目 录
摘要………………………………………………………………………………3
关键词……………………………………………………………………………3
1.概况……………………………………………………………………………3
2.临床应用………………………………………………………………………3
3.青霉素生产流程………………………………………………………………3
4.发酵过程控制…………………………………………………………………4
5.青霉素的提炼工艺过程………………………………………………………5
参考文献…………………………………………………………………………6
致谢………………………………………………………………………………7
青霉素的生产工艺
摘要
青霉素是一种重要的抗生素，在目前的制药工业中占有重要地位，生产规模非常大。通过多年的完善，青霉素针剂和口服青霉素已经分别治疗肺炎，心内膜炎等病。增强了人类治疗传染疾病的能力，研究和优化其生产工艺对人类健康有重要意义。
关键词 青霉素 生产工艺
1 概况
青霉素是抗菌素的一种，指从青霉菌培养液中提取的分子中含有青霉烷，能破坏细菌细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起到杀菌的作用的一类抗生素，是一类可以治疗人类疾病的抗生素。它不但耐受耐药菌株所产生的酶，易被其破坏，且抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。最初青霉素的生产菌是音符性青霉菌，生产能力只有几十个单位，不能满足工业需要。随后找到了适合于深层培养的橄榄型青霉菌，即产黄青霉，生产能力为100u/ml。经过X、紫外线诱变生产能力达到1000-1500u/ml，随后经诱变，得到不产生色素的变种，目前生产能力达到66000-70000u/ml。青霉素是抗生素的首要产品，中国为青霉素的生产大国，国内生产青霉素已占世界产量的近百分之七十，国内较大规模的生产企业有华药、哈药、石药等单个发酵罐规模均在100立方米以上，发酵单位在70000u/ml左右，而世界青霉素工业发酵水平达100000u/ml以上。
2 临床应用
40多年，主要控制敏感金黄色葡萄球菌，链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对于大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性菌。
第1期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。
第2期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。
第3期：形成脂肪包涵体，机理贮藏物，没有空泡，嗜碱性很强。
第4期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。
第5期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。
第6期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状。释放游离氨，pH上升。
第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。
镜检：规定时间取样，显微镜观察7个时期的形态变化，控制发酵。 1－4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。4－5期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产在第六期到来之前结束发酵。
3 青霉素生产流程
冷冻干燥孢子→琼脂斜面→米孢子→种子罐→发酵罐→过滤→醋酸丁酯提取→脱水脱色→结晶→洗涤晶体→工业盐→菌丝体→综合利用
3.1发酵工艺过程
（1）生产孢子的制备
将砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经传代活化。最适生长温度在25~26 ℃，培养6~8天，得单菌落，再传斜面，培养7天，得斜面孢子。
移植到优质小米或大米固体培养基上，生长7天，25℃，制得小米孢子。每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。
（2）种子罐和发酵罐培养工艺
种子培养要求产生大量健壮的菌丝体，因此，培养基应加入比较丰富的易利用的碳源和有机氮源。青霉素采用三级发酵
一级种子发酵：发芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌发，形成菌丝。培养基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。通无菌空气，空气流量1：3（体积比）；充分搅拌300－350r/min；40~50小时；pH自然，温度27±1℃。
二级发酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米浆、葡萄糖等。1：1－1.5；250－280r/min；pH自然，25±1℃；0－14h。
三级发酵罐：生产罐。花生饼粉（高温），麸质粉、玉米浆、葡萄糖，尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰胺及消泡剂，CaCO3等。接种量为12~15%。青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通气比控制0.7~1.8；150－200r/min；要求高功率搅拌，100 m3的发酵罐搅拌功率在200~300 Kw，罐压控制0.04~0.05Mpa，于25~26 ℃下培养，发酵周期在200h左右。前60hpH5.7~6.3，后6.3~6.6；前60h为26℃，以后24℃。
4 发酵过程控制
反复分批式发酵，100m3发酵罐，装料80m3，带放6－10次，间隔24h。带放量10％，发酵时间204h。发酵过程需连续流加补入葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。
在青霉素的生产中，让培养基中的主要营养物只够维持青霉菌在前40h生长，而在40h后，靠低速连续补加葡萄糖和氮源等，使菌半饥饿，延长青霉素的合成期，大大提高了产量。所需营养物限量的补加常用来控制营养缺陷型突变菌种，使代谢产物积累到最大。
4.1培养基
青霉素发酵中采用补料分批操作法，对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加，维持一定的最适浓度。葡萄糖的流加，波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖浓度调节是根据pH，溶氧或CO2释放率予以调节。
碳源的选择：生产菌能利用多种碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。经济核算问题，生产成本中碳源占12％以上，对工艺影响很大；糖与6-APA结合形成糖基-6-APA，影响青霉素的产量。葡萄糖、乳糖结合能力强，而且随时间延长而增加。通常采用葡萄糖和乳糖。发酵初期，利用快效的葡萄糖进行菌丝生长。当葡萄糖耗竭后，利用缓效的乳糖，使pH稳定，分泌青霉素。可根据形态变化，滴加葡萄糖，取代乳糖。目前普遍采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流加。降低成本。
氮源：玉米浆是最好的，是玉米淀粉生产时的副产品，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代。补加无机氮源。
无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁有毒，控制在30µg/ml以下。
流加控制：补糖，根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。残糖在0.6％左右，pH开始升高时加糖。
补氮：流加酸酸铵、氨水、尿素，控制氨基氮0.05%。
添加前体：合成阶段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可为青霉素侧链的前体，直接掺入青霉素分子中。也具有刺激青霉素合成作用。但浓度大于0.19％时对细胞和合成有毒性。还能被细胞氧化。策略是流加低浓度前体，一次加入量低于0.1%，保持供应速率略大于生物合成的需要。
4.2温度
一生长适宜温度30℃，分泌青霉素温度20℃。但20℃青霉素破坏少，周期很长。生产中采用变温控制，不同阶段不同温度。前期控制25－26℃左右，后期降温控制23℃。过高则会降低发酵产率，增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化得率。有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间，生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。
4.3 pH
合成的适宜pH6.4－6.6左右，避免超过7.0，青霉素在碱性条件下不稳定，易水解。缓冲能力弱的培养基，pH降低，意味着加糖率过高造成酸性中间产物积累。pH上升，加糖率过低不足以中和蛋白产生的氨或其他生理碱性物质。前期pH控制在5.7~6.3，中后期pH控制6.3~6.6，通过补加氨水进行调节。pH较低时，加入CaCO3、通氨调节或提高通气量。pH上升时，加糖或天然油脂。
一般直接加酸或碱自动控制，流加葡萄糖控制。
4.4溶氧
溶氧＜30％饱和度，产率急剧下降，低于10％，则造成不可逆的损害。所以不能低于30％饱和溶氧浓度。通气比一般为1：0.8VVM。溶氧过高，菌丝生长不良或加糖率过低，呼吸强度下降，影响生产能力的发挥。适宜的搅拌速度，保证气液混合，提高溶氧，根据各阶段的生长和耗氧量不同，对搅拌转速调整。
4.5菌丝生长速度与形态、浓度
对于每个有固定通气和搅拌条件的发酵罐内进行的特定好氧过程，都有一个使氧传递速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上达到平衡的临界菌丝浓，超过此浓度，OUR＞OTR，溶氧水平下降，发酵产率下降。在发酵稳定期，湿菌浓可达15~20%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。另外，因补入物料较多，在发酵中后期一般每天带放一次，每次放掉总发酵液的10%左右。
有丝状生长和球状生长两种。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触，比生产率高，发酵粘度低，气/液两相中氧的传递率提高，允许更多菌丝生长。球状菌丝形态的控制，与碳、氮源的流加状况，搅拌的剪切强度及稀释度相关。
4.6消沫
发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。少量多次。不适在前期多加入，影响呼吸代谢。
青霉素的发酵过程控制十分精细，一般2 h取样一次，测定发酵液的pH、菌浓、残糖、残氮、苯乙酸浓度、青霉素效价等指标，同时取样做无菌检查，发现染菌立即结束发酵，视情况放过滤提取，因为染菌后pH值波动大，青霉素在几个小时内就会被全部破坏。
5 青霉素的提炼工艺过程
青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止降解。
5.1预处理
发酵液结束后，目标产物存在于发酵液中，而且浓度较低，如抗生素只有10－30Kg/m3，含有大量杂质，它们影响后续工艺的有效提取，因此必须对其进行的预处理，目的在于浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。是进行分离纯化的一个工序。
5.2过滤
发酵液在萃取之前需预处理，发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过滤或板框过滤，除掉菌丝体及部分蛋白。青霉素易降解，发酵液及滤液应冷至10 ℃以下，过滤收率一般90%左右。
（1）菌丝体粗长10µm，采用鼓式真空过滤机过滤，滤渣形成紧密饼状，容易从滤布上刮下。滤液pH6.27-7.2，蛋白质含量0.05-0.2%。需要进一步除去蛋白质。
（2）改善过滤和除去蛋白质的措施：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土为助滤剂。再通过板框式过滤机。滤液澄清透明，进行萃取。
5.3萃取
青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2－3次。从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择1.8-2.0，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择6.8-7.4。发酵滤液与乙酸丁酯的体积比为1.5-2.1，即一次浓缩倍数为1.5-2.1。为了避免pH波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。发酵液与溶剂比例为3－4。几次萃取后，浓缩10倍，浓度几乎达到结晶要求。萃取总收率在85％左右。所得滤液多采用二次萃取，用10%硫酸调pH2.0~3.0，加入醋酸丁酯，用量为滤液体积的三分之一，反萃取时常用碳酸氢钠溶液调pH7.0~8.0。在一次丁酯萃取时，由于滤液含有大量蛋白，通常加入破乳剂防止乳化。第一次萃取，存在蛋白质，加0.05-0.1%乳化剂PPB。
萃取条件：为减少青霉素降解，整个萃取过程应在低温下进行（10 ℃以下）。萃取罐冷冻盐水冷却。
5.4脱色
萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，除去活性炭。
5.5结晶
萃取液一般通过结晶提纯。青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸钾-乙醇溶液，青霉素钾盐就结晶析出。然后采用重结晶方法，进一步提高纯度，将钾盐溶于KOH溶液，调pH至中性，加无水丁醇，在真空条件下，共沸蒸馏结晶得纯品。
直接结晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠－乙醇溶液反应，得到结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液，得到青霉素钾盐。
共沸蒸馏结晶：萃取液，再用0.5 M NAOH萃取，pH6.4-4.8下得到钠盐水浓缩液。加2.5倍体积丁醇，16－26℃，0.67-1.3KPa下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥后，得到青霉素产品。
参考文献
[1] 白远,罗风,北京市生物制药产业国际竞争力研究 [J],国际经济合作, 2004年05期,19-22
[2] 辛旭,胡丹风,孙志晶,周希彬,李鹏,陈爽,李施,邹积宏,张宏,抓住契机 夯实基础——黑龙江省生物制药产业的发展[J],黑龙江医药,2007年01期 3
[3] 霍永良,杨建梅,生物制药产业集群式发展的原因探讨[J],科技进步与对策,2005年
[4] 和文华,于克信,从市场潜力看云南生物制药产业的未来发展[J],云南财贸学院学报,2002 年04期
[5] 文淑美. 全球生物制药产业发展态势;中国生物工程杂志, 2007,27(7): 117-121
[6] 4 王红权,蓬勃发展的石药集团生物制药产业[J],中国科技投资,2007年06期
[7] 胡显文,陈惠鹏,汤仲明,马清钧,美国、欧盟和中国生物技术药物的比较〔Ｊ〕,中国生物工程杂志,2005,25(2),82～
[8] 刘晓郁,(我国生物制药产业知识产权布局前景堪忧) 刊名 中国医药导报,2006 年3卷J].
[9] 李玉彬,钱晓璐,生物制药产业发展现状与趋势 - 现代农业科技,2010 年第 15 期
致谢
在论文的写作过程中我遇到了无数的困难和障碍，这些困难都在同学和老师的帮助下度过了。尤其要强烈感谢我的论文指导老师，杨思远老师，她对我进行了无私的指导和帮助，不厌其烦的帮助进行论文的修改和改进。在此向帮助和指导过我的杨思远老师表示最衷心的感谢！
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