红豆杉内生真菌产紫杉醇研究

摘 要:从红豆杉分离的紫杉醇内生菌条件要求比较高，且价格昂贵，为了寻求更有效的办法来分离产生紫杉醇，我们进行了有效的紫杉醇方面的研究，本文综述了近年来产紫杉醇的红豆杉内生真菌分离和筛选、代谢和发酵的研究进展。

关键词:紫杉醇;红豆杉;内生真菌

紫杉醇(Taxol,商品名Paclitaxel),分子式C47H51 NO14,分子量853,是一种从红豆杉属植物Taxus中提取出来的天然抗癌药物。其抗癌机理在于能与微蛋白结合,并促进其聚合,抑制癌细胞的有丝分裂, 有效阻止癌细胞的增殖。目前，紫杉醇的主要来源有：组织培养、扦插、种子育苗、液体悬浮培养、内生菌及产紫杉醇内生菌的分离和培育紫杉醇的合成以及基因工程等方面。其中，以内生真菌生产紫杉醇的方法具有远大的发展前途，不但能够获得生理活性与植物来源一致的紫杉醇，而且利于工业化生产，成本也相应较低。现如今，主要的问题在于紫杉醇的产量低，价格昂贵，如果解决这些问题，紫杉醇的内生真菌的工业化生产就可以实现，相对来讲价格也会相应的降低，从而为众多的癌症患者带来福音，本文主要介绍近年来红豆杉内生真菌的发现和分离情况及其产紫杉醇的研究进展。

1 红豆杉内生真菌的分离内生真菌(endophyticfungus)是一大类未被充分认识的真菌,它泛指那些生活在健康植物体内不引起任何病害症状的所有真菌。至今已发现的产紫杉醇的内生真菌,基本上都是从红豆杉属植物中分离得到的,也有个别从非红豆杉植物中分离的例子。

1.1 菌种分离纯化方法 现一般采用的分离纯化方法为:将红豆杉树皮切成小块置于75%的酒精中消毒,用无菌水冲洗后,置于马铃薯固体平板培养基(PDA)上,待培养一段时间由外植体周围长出菌丝后,挑取形态不同菌落的菌丝尖端,分别接种到PDA固体培养基上培养,长出新菌落后,再反复多次纯化即可得到纯的菌株。若在培养基中加少量链霉素,可以抑制细菌的生长,便于真菌的分离。

1.2 已分离发现的内生真菌现已分离发现的红豆杉内生真菌种类不同形态各异,次生代谢产物也各不相同,有紫杉醇,巴卡 亭Ó,紫杉酚,芳香族氨基酸脱羧酶等。其中紫杉醇产率为0.024 ~185.4L g/L,这些发酵产量水平是很低的,通过生物技术得到的内生真菌融合子的紫杉醇产率也只达到448.52L g/L,距工业化生产仍还有相当距离。一般来说,发酵产量的水平要达到1 mg/L左右才有工业生产价值。

2 红豆杉内生真菌次生代谢产物的研究。全世界现已发现69000种真菌,且每年还以 1000余种的新种递增,保守估计现总数可达150余 万种。同时真菌产生的次生代谢产物超过一千多种,而且往往为种或株系所特有。国内外学者通过TLC、 MS、HPLC、UV、免疫分析、生物学试验、放射性前体标记等手段对红豆杉内生真菌次生代谢产物进行了鉴定,均发现有些菌株并成为近年来研究的热点。内共生理论认为,次生代谢过程中生物化学途径的连续演化会导致有益物质进入到共生体中,且一旦次生代谢中有生化途径出现,它就能被其它生物利用,表现出相互作用和协同进化。由此产生的假设是:具有相同次生代谢产物生物合成的途径是获得了相关基因的直接传递。

3 影响真菌发酵生产紫杉醇产量的因素

3.1 发酵用培养基 张理珉等以分离自云南红豆杉的内生真菌M1为实验菌,对液体和固体发酵培养基进行比较, 发现菌株在固体培养基中的生长要比液体培养基中好,估计可能由于真菌存在于树皮中,水分含量低, 所以更适于固体培养基。但液体培养基运用更为广泛,目前一般采用摇瓶和小罐式发酵。张亚妮等用分离自中国红豆杉的T14菌株进行试验时则发现用氯化铵和硫酸铵为N源较好,蛋白胨却使紫杉醇的产量急剧下降。这可能是由于菌种不同而 造成的差异。由于紫杉醇及其类似物在红豆杉植物中的合成是共同的二萜前体物牛儿焦磷酸环化及一系列以氧化为主的修饰作用生成紫杉醇,且紫杉烷骨架的生物合成是经甘油醛3 -磷酸酯/丙酮酸途径实现的。

3.2 培养基添加物放射性同位素标记前体物饲喂实验结果表明: 紫杉醇的紫杉烷三环二萜骨架来自羟甲基戊酸,乙酰基来自乙酸,而C -13位酯基侧链中 C6H5CH2CH2COHCOO -来自苯丙氨酸;同时研究也表明苯丙氨酸是合成紫杉醇的前体。前体的添加可促进紫杉醇的生物合成。刘晓兰等均分别在小孢盘多毛孢和树状多节孢发酵培养基中加入苯丙氨酸,其紫杉醇产量均得到一定提高;同时加入一定量的醋酸钠也能提高产量。细胞在不断合成伸展蛋白、木质素的时候,会大量消耗酪氨酸和部分苯丙氨酸,从而导致苯丙氨酸向酪氨酸的转化,这显然对紫杉醇的合成不利。因此适量加入酪氨酸将抑制该转化反应,从而达到保护苯丙氨酸的效果。实验证实加入酪氨酸对紫杉醇的合成起促进作用,能提高其产量。在对小孢盘多毛孢的培养基中添加RNA酶抑制剂硫酸氧矾后,发现发酵液中紫杉醇的含量提高数倍,但其它几种RNA酶抑制剂硫代月桂酯和硫代聚乙烯酯则影响不明显。RNA酶抑制剂硫酸氧矾提高紫杉醇产量的具体机制尚不清楚。

3.3 培养时间和通气量 刘晓兰等通过测定不同培养时间发酵液中紫杉醇的含量,发现培养时间为16~18d时,紫杉醇含量较高,估计应与真菌的代谢周期有关。因内生真菌多为耗氧性微生物,因此不同浓度 氧气、二氧化碳对细胞生长和紫杉醇产量有很大影响。低浓度氧气(体积比10%)促进紫杉醇产生,高浓度二氧化碳(体积比10%)则抑制其产生。在树状多节孢的发酵过程中,溶氧量为150mL/500mL 时效果最好,所以适量通气,保持合适的溶氧浓度有助于提高产量。

4 红豆杉内生真菌在非发酵途径上的应用

4.1 转化合成紫杉醇

某些真菌具有将前体物乙酰化和差象异构化的能力,其原因在于真菌在发酵过程中产生了特异性的酶。这为真菌在紫杉醇的合成中开辟了另一条可行的途径。

4.2诱导红豆杉细胞提高紫杉醇产量 近十几年来,国内外在组织细胞培养中利用真 菌诱导物刺激提高目的次生代谢产物产量的研究是个热点。而红豆杉内生真菌也可制备诱导物对红豆杉细胞进行诱导,提高紫杉醇的产量。内生真菌不仅可以通过自身发酵产紫杉醇,还可以通过制备诱导物运用于红豆杉细胞培养生产紫杉醇。

5 结束语 利用红豆杉内生真菌生产紫杉醇的优点在于: 易于大规模培养;能在简单培养基上生长;比生长速 率高,可获得大量产物等。但目前发现的菌株的产量均未达到工业化生产的要求（产量在1mg/L ）以上。其关键问题在于内生真菌的分离筛选和紫杉醇产量的提高。就技术而言,有三个途径认为是可行的:

其一是改造发酵工艺,优化发酵条件;

其二是改造菌种;

其三是寻找一个特殊的真菌调节剂。如果再将现代微生物技术诱变育种以及基因工程技术与以上提及的方法相结合,一定会筛选培养出高产量的菌株,进行工业化生产,从而解决紫杉 醇短缺的问题,同时起到保护生态环境,为人类造福的积极作用。